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1. 페프로텍의 Western Transfer protocol를 수행할 때 Immunostaining은 얼마나 시간이 걸리나요?
Western Transfer 과정은 단백질의 transfer 밴드가 보이기까지 적어도 6시간이 걸립니다.

2. 어떤 형태의 molecular weight marker를 사용해야 되나요?
페프로텍은 모든 western transfer를 수행할 때 Novex^Ⓡ Sharp Pre-Stained Protein Standard를 사용하지만, 꼭 이 marker를 사용할 필요는 없습니다. 하지만, ECL detection method를 사용하지 않을 때는 pre-stained molecular weight marker를 사용할 필요가 있습니다.

3. Western Transfer에 positive control 추가가 필요한가요?
네. 원하는 단백질이 western transfer에 어떻게 보일지를 정확히 알기 위해서 반드시 positive control를 gel에 올려야 합니다. 페프로텍의 항체를 사용할 때 항체 선택을 위해 사용했던 항원인 페프로텍의 재조합단백질 사용을 권합니다.

4. Incubation 중에 Membrane의 Agitation이 꼭 필요한가요?
네. 꼭 필요합니다. 만약에 agitation하지 않으면 항체, blocking buffer, 그리고 washing buffer가 membrane에 고르게 영향을 미칠 수 없고 background에 splotchy 또는 patchy가 남을 수 있습니다. 항체가 단백질을 검출하는 데에 제한을 받을 수도 있습니다.

5. Protein Transfer과정에 Blotting Paper가 필요하나요?
네. Protein transfer과정에서 barrier로서 blotting paper가 필요합니다. 스폰지에 직접 닿아서 생길 수 있는 손상으로부터 gel과 membrane을 보호하는데 도움이 되고, 전류를 방해하지는 않기 때문입니다.

6. 페프로텍의 Western Transfer protocol에 권장되는 color development System을 사용해야 하나요?
Western transfer에 사용되는 많은 종류의 color development system들이 있습니다. 하지만 반드시 사용하신 enzyme conjugate에 적합한 system을 선택하셔야 합니다. 페프로텍은 secondary 항체가 연결된 alkaline phosphatase를 사용합니다. NBT/BCIP는 효소에 적합하므로 저희의 western transfer에 사용합니다.

7. 같은 항체의 다른 lot를 사용할 때 어떤 Western Transfer에서는 다른 것 보다 더 강한 결과가 나오는 이유는 무엇인가요?
Polyclonal 항체의 특성으로 인해, lot-to-lot 차이점이 나타날 수 있습니다.

8. Western Transfer에서 Primary/Secondary Antibody System을 사용하는 것 보다 Enzyme-Conjugated Primary Antibody를 사용할 수 있나요?
네. Enzyme-Conjugated Primary 항체를 대신 사용할 수 있습니다. 하지만, antigen specific primary 항체를 인식하는 labeled secondary 항체를 사용함으로써, western transfer에서 enzyme-conjugated primary 항체를 사용한 것에 비교할 때 signal이 증폭되어 보일 겁니다.