Registration for PeproTech.com is no longer available. To order your PeproTech products online, register or logon to ThermoFisher.com.

Resources & Support

Protocols - Antigen Affinity Purification of Antibodies

细胞因子是全身细胞间通讯所必需的信号蛋白。 根据其在保存重要生物学功能中的作用,来自不同哺乳动物物种的同源细胞因子的氨基酸序列通常是高度保守的,从而导致抗体生产的免疫原差。
因此,用细胞因子免疫后从宿主动物获得的血清(Figure I-1)通常含有微量的细胞因子特异性抗体。 通过标准纯化方法(例如离子交换层析)不能够有效的分离这些抗体。 另一方面,利用抗体对某些生物分子的结合亲和力的纯化方案已经得到了更好的结果。

Figure I-1 兔源多克隆抗体生产的一般方法

General Immunization Schedule for PAb Prod in Rabbits

例如,protein A和 protein G是细菌(葡萄球菌)衍生的蛋白质,对免疫球蛋白(IgG)的Fc(片段可结晶)区域具有高结合亲和力。当连接到固体支持基质上时,他们能够有效地从其他血清成分中分离IgG 。 protein A / G亲和纯化血清IgGs ,通常可以将所需抗体富集超过100倍。 然而,在抗细胞因子抗体存在的情况下,总IgG部分通常含有不到0.2%的所需抗体。.

在这些制备中大量不相关的IgG不仅干扰细胞因子特异性抗体的相对量的定量,而且当抗体用于分析过程如ELISA,中和,免疫组化和 蛋白质印迹中时会大大增加背景噪音。 从抗血清中分离特异性多克隆抗体的更佳方法就是是通过亲和层析的方法,亲和层析是利用抗体 - 抗原相互作用的特异性(FigureI-2)。

Figure I-2 抗体的抗原亲和纯化

Antigen Affinity Purification of Antibodies

这里,分离介质由抗原通过稳定的共价键连接的固体支持介质树脂组成。 然后将固化的抗原用于柱色谱装置中以选择性捕获抗原特异性抗体,而其它血清蛋白和不相关的免疫球蛋白则不会结合. 
(Figure I-3).

Figure I-3 用于抗体的抗原亲和纯化的柱色谱法的示意图

Schematic Illustration of Column Chromatography SetUp

抗原结合的抗体可以通过酸性溶液从柱洗脱(Figure I-4),要迅速恢复到生理pH以防止酸催化的抗体变性。 该方法通常产生> 95%纯度的特异性抗体(图I-5)。

Figure I-4A 典型抗原亲和纯化色谱

Chromatogram and SDS-PAGE gel