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1. 采用PeproTech的Western Blot方案时，免疫染色步骤需要花费多长时间？
该Western Blot方案中，从蛋白转膜到条带显色共约需6个小时。

2. 需用什么类型的蛋白分子量marker？
PeproTech在自己的实验室做Western Blot实验时，均使用Novex^® Sharp预染蛋白marker，当然该蛋白marker不是一定要用。用非ECL法显色时，一定要用预染的分子量marker。

3. Western Blot一定要做阳性对照吗？
是的。为了准确了解目的蛋白在Western Blot中的条带位置，您必须在胶中设置阳性对照。当用PeproTech的抗体做Western Blot时，我们建议您用PeproTech公司生产的相应重组蛋白，即该抗体的免疫原作为阳性对照。

4. 膜在孵育期间一定要振荡吗？
是的，在孵育期间对膜进行振荡十分必要。如果不振荡，抗体、封闭液和洗液可能无法均匀地作用于整个膜，从而导致膜上出现斑点或斑块状背景，同时也会影响抗体对蛋白的检测。

5. 蛋白转膜时，一定要用滤纸吗？
是的，蛋白转膜时必须使用滤纸作为屏障。滤纸可避免胶或膜因与海绵直接接触而发生损坏。滤纸对转膜的电流没有影响。

6. 必须用PeproTech的Western Blot方案中推荐的显色系统吗？
不一定。Western Blot实验可用的显色系统很多，但要注意，显色系统必须与所用的酶相配。PeproTech使用碱性磷酸酶标记的二抗，NBT/BCIP因是碱性磷酸酶的底物，所以用于我们Western Blot实验中的显色。

7. 为什么使用不同批次的同一种抗体时，Western Blot实验的结果强弱有别？
这是多克隆抗体本身的特性导致的，不同批次间可能会有差异。

8. 在Western Blot实验中，是否可以用酶标一抗替代一抗/二抗检测系统？
可以的，但要注意，与仅用酶标一抗相比，用酶标记的二抗来识别抗原特异性的一抗，即一抗/二抗检测系统，对Western Blot的信号有放大作用。